仪器计量检测：多糖分析检测

仪器计量检测：多糖分析检测

糖基化是许多治疗蛋白的重要翻译后修饰，尤其是单克隆抗体(mAb)，已成为一项大生意。由于聚糖构件、链长和排列(包括位置和结构异构体)的无限组合，以及糖在分析中几乎无法区分的事实，聚糖分析已经成为一个越来越外包的分析专业。糖基化是单克隆抗体的主要“关键质量属性”，因此多聚糖分析是一种重要的方法，可用于过程监控、质量控制和建立生物相似性的指定药物。多糖及其在蛋白质中的表达类似地用作表达单克隆抗体和其他生物治疗剂的细胞系的选择标准。

　　流动相，液相色谱-质谱

　　液相色谱-质谱(LC-MS)已成为聚糖分析的标准分析平台，但关键结构的基线分辨可能需要几个小时。即便如此，异构聚糖和糖肽或质量相似或相同的聚糖和糖肽并不总是分开的。2021年6月，MOBILion  Systems推出了MOBIE，这是该公司首款商用高分辨率离子迁移质谱(HRIM-MS)系统，基于太平洋西北实验室2015年开发的新分离技术。MOBIE背后的驱动力是“结构无损离子操纵”(SLIM)，它需要长路径的离子迁移率分析，并将其折叠回自身数次，从而减少其占用的空间。例如，对于常规实验室分析来说不切实际的13米线性流动路径可以缩小到公文包大小。进入分析路径的材料由路径周围的电场引导，以避免分析物和设备之间的碰撞，因此使用“无损”一词来描述分子路径。

　　HRIM质谱在几个方面不同于液相色谱。首先，它发生在气相和液相色谱的溶液中。分子是根据液相色谱电荷或分子量分离的，而HRIM质谱利用分析物的大小、电荷、形状和结构。HRIM-质谱还将分析时间从典型的15分钟缩短到3小时，然后再缩短到2分钟左右，从而从根本上消除了通量瓶颈。该技术适用于单克隆抗体、整体和亚单位蛋白质、肽和多糖从研究阶段到生产阶段。

　　MOBILion  Systems首席执行官Melissa  Sherman博士表示：“高度相似的生物分子(如许多聚糖)的LC分离需要延长运行时间，这在分析工作流程中造成了潜在的瓶颈。”“即便如此，一些聚糖的行为仍然如此相似，以至于不能避免LC的共同流出。相比之下，运行支持MOBIE的MS系统两分钟，可为研究环境中蛋白质、肽、多糖和PTM的分离和分析提供高通量和高分辨率选项。我们相信，这种方法可能会减少在过程监控和制造中使用更复杂的基于质谱的表征分析的障碍。”许多分析聚糖的分析师(如果不是全部的话)都试图解决“异构体”的问题，即分子量相同但糖残基排列不同的——。“HRIM-质谱确实可以帮助识别分辨率和通量更高的异构体图谱，”谢尔曼告诉生物公司。“糖基化曲线需要用LC在两分钟左右分离6小时，再用HRIM分离。”

　　多层次可能性

　　治疗性蛋白质(也称为“糖蛋白质组学”)的聚糖分析发生在大约四个水平：在完整蛋白质上，通过部分消化的蛋白质，在单个糖基化肽上，以及在聚糖首先从蛋白质中释放出来之后。

　　基因编辑和治疗公司Prime  Medicine的高级科学家杨洋博士说，糖链分析的水平取决于调查的目的和具体的分析物结构。“例如，当蛋白质中有多个聚糖位点时，你可能需要将蛋白质消化成糖肽来研究每个单独的位点。”几个“水平”也可能参与分子表征过程，为监管提交做准备，“其中使用多种正交方法在释放的聚糖、糖肽和完整糖蛋白水平上表征聚糖。”

　　分析人员转向释放的聚糖，对细胞、组织或血浆/血清表达的糖蛋白上的单个N-和O-糖基化位点进行准确和全面的聚糖分析。

　　另一方面，糖肽分析用于研究一种或多种蛋白质上的多糖。“这种方法的主要特点是可以将糖基化信息与蛋白质中的糖基化位点联系起来，”CD生物基因的研究科学家Linda  Brown说。“然而，有必要对整个糖蛋白治疗剂进行分析，以量化纯化的糖蛋白治疗剂的N-/O-糖基化，包括计算糖基化位点上每种聚糖的百分比，并估计每种N/O-聚糖的结构。”

　　BioGlyco专门通过聚糖分析来改进生物治疗药物，这是一种潜力巨大的策略，但通常使用不足。

　　我们倾向于认为聚糖分析主要与质量功能有关，但糖蛋白组学也在药物发现和创造现有生物制药的改进版本中发挥作用。

　　“糖基化是一个非常有前途的目标，在个性化医疗方面有很大的潜力，”布朗继续说道。“多糖在生物过程中发挥重要作用，包括细胞粘附、大分子相互作用和病原体入侵。糖组学是基因组学、代谢组学和蛋白质基因组学的补充，显示了个性化医学的前景。例如，某些疾病的糖生物标志物可能对个体具有特异性，因此针对特定蛋白质的糖基化是一种有前途的临床治疗策略。”这些策略可以应用于现有的“个性化”生物治疗药物和专门用于糖基化的新化合物。全阶段活动？

　　由于所涉及的专业知识和时间，生物治疗药物的开发人员倾向于将聚糖分析保留在产品生命周期的书架上，——处于发现和开发以及QC的*早表征阶段。随着对糖基化的进一步了解，这种情况正在改变。

　　“糖蛋白在分子和细胞功能中起着关键作用，”创意生物实验室的首席技术官张箐博士说。“治疗性糖蛋白的稳定性、血清半衰期、免疫原性和生物活性受其糖基化特征的调节。因此，在生物制剂的所有开发阶段，对糖基化特征的需求都在增加。”

　　越来越多的开发人员在生产和质量检测过程中进行聚糖分析。Creative  Biolabs专注于高通量筛选抗体、Fc融合蛋白、非Fc融合蛋白和糖工程细胞系的策略。"*重要的是，分析是实时进行的，以监控生产过程."一种策略包括通过UHPLC和荧光检测进行高通量聚糖筛选，这可以在两周内筛选多达100个样品，并使用粗澄清介质。张说，基于荧光标记凝集素的第二次高通量筛选大约需要两个小时。

　　随着对糖基化重要性的更好理解，聚糖分析正在成为一项需要时间、仪器和专业知识的专业活动，药物开发人员越来越缺乏或不愿意获得这些。因为糖基化修饰的QC只发生在特定的时间(虽然频率在增加)，所以聘请第三方服务提供商可能比内部维护这个功能更方便、更划算。

　　全世界有130多个组织专门从事多糖分析。英国研究公司Roots  Analysis的一项研究显示，未来几年这一细分市场的年增长率将增长15%，这一细分市场服务于每年1300亿美元的糖基化蛋白药物市场需求。

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